Методы идентификации выделенных вирусов
Выделенный вирус необходимо идентифицировать, т.е. установить, какой это вирус ( семейство, род, вид). Идентификацию неизвестного ( выделенного) вируса проводят с помощью серологических реакций: РТГА, РТГАд, РН, РИФ, ИФА, РНГА, РСК, РДП, и др. При этом выделенный вирус используют как антиген и с ним в серологических реакциях применяют специфические сыворотки, содержащие антитела к заведомо известным вирусам. Та сыворотка, с которой выделенный вирус будет давать продолжительную реакцию ( образование комплекса антиген+ антитело) и укажет, какой это вирус.
Важно правильно выбирать серологическую реакцию. Каждая лаборатория предпочитает те или иные методы, основываясь на чувствительности, специфичности, скорости. Удобствах и стоимости. Так, если вирус выделели на культуре клеток и он дает гемадсорбацию, то проще и быстрее его идентифицировать в РТГАд. Например, вирус ПГ-3 крупного рогатого скота дает гемадсорбцию с эритроцитами морской свинки и может быть идентифицирован в РТГАд. Вирусы, обладающие гемагглютинирующей активностью, целесообразно идентифицировать в РТГА.
Для идентификации выделенных вирусов используют РИФ, ИФА, РНГА, РДП, ПСК. Наиболее универсальной и дающей более достоверные результаты при идентификации выделенных вирусов является РН, в которой используют теже живые чувствительные системы, на которых и был выделен исследуемый вирус.
Применение моноклональных антител с определенной специфичностью прозволяет проводить идентификацию многих вирусов до уровня подтипов, штаммов или вариантов. Для обнаружения и идентификации вирусов кроме серологических реакций используют прямые методы идентификации вирусных нуклеиновых кислот: ДНК-зонды, полимеразную цкпную реакцию (ПЦР). С их помощью выявляют нуклеиновые кислоты вирусов.
Методы ДНК (или РНК)-зондов основаны на реакции гибридизации нуклеиновых кислот- способности односпиральных комплементарных цепей ДНК или РНК формировать двуспиральные структуры. Реакция может протекать между комплементарными молекулами вида : ДНК+ДНК,ДНК+РНК,РНК+РНК.
Геном вирусов, представленный в виде специфической последоватедльности нуклеидов в молекулах нуклеиновых кислот, наиболее информативен и является надежным критерием для идентификации.
У большинства ДНК- содержащих вирусов (адено-,герпес-, покс-,папилломавирусы и др.) нуклеиновая кислота находится в виде двух цепей, которые связаны ( водородная связь) комплементарно через азотистые основания ( аденин-тимин,гуанин-цитозин).
5”___________Г А А Т Т Ц____________3”
||| || || || || |||
3”__________ Ц Т Т А А Г ____________5”
Так , у аденовирусов таких нуклеидных пар 35-36,5 тыс., у герпесвирусов- 125-240 тыс., у поксвирусов-130-375 тыс. и т.д.
Если водный раствор ДНК нагреть до 100°С или сильно защелочить( рН 13), то комплементарные пары оснований теряют связь, и ДНК быстро дисоциирует на две отдельные цепи. Этот процесс называется денатурацией или плавлением.
Если комплементарные цепи ДНК выдерживать в течении определенного времени при температуре 65 гр.С, они легко спариваются, восстанавливая структуру двойной спирали. Этот процесс получил название ренатурация или гибридизация.
Все типы реакций гибридизации зависят от солевого состава среды, температуры инкубации, длины реагирующих цепей, их нуклеотидного состава.
Любой вирус включает одну специфическую для него молекулу ДНК(илиРНК) со строго определенной последовательностью нуклеотидов. Чтобы в исследуемом материале обнаружить вирусную нуклеиновую кислоту, можно воспользоваться ее способностью после разделения цепей( если она двуспиральная) образовывать снова двойную цепь с комплементарной ей молекулой нуклеиновой кислоты, предварительно как – либо помеченной. Такая меченая односпиральная молекула нуклеиновой кислоты, комплементарная молекуле нуклеиновой кислоты определенного вируса, называется ДНК-зондом. Для каждого вида вируса зонд готовят заранее и вводят в него метку в виде атома радиоактивного фосфора(32Р) или в виде биотина, или другим веществом.
Методы ДНК-зондов сводятся к следующему:
l получение односпирального фрагмента ДНК определенного вируса иего метки-это ДНК-зонд;
l выделение из исследуемого материала нуклеиновых кислот и их денатурация;
l контакт образовавшихся односпиральных молекул ДНК(или РНК-зондом при 55-56 гр.С, приводящих к образованию двуспиральных молекул (гибридизация) в случаях их взаимной комплементарности;
l удаление всех негибридизированных односпиральных молекул нуклеиновых кислот ( отмывают или добавляют нуклеазы);
l обнаружение ( по метке) образовавшихся двуспиральных молекул нуклеиновых кислот, которые и будут указывать на наличие в исследуемом материале того вируса, на который был получен ДНК-зонд.
Если использовали радиоактивный зонд, то результаты учитывают методом авторадиографии или путем подсчета импульсов в счетчике.
Существует большое количество модификаций метода гибридизации с мечеными нуклеиновыми кислотами. Их можно разделить на две основные группы: способы ибридизации в растворе и способы гибридизации на твердых носителях.
Наиболее популярен метод гибридизации с использованием носителей-нитроцеллюлозных или нейлоновых фильтров и твердых полимеров. Он заключается в том, сто одну нуклеиновую кислоту(чаще исследуемую), предварительно денатурированную,иммобилизуют на носителе ( фильтре), проводят гибридизацию с ДНК-зондом и непрореагировавшие молекулы зонда отмывают, а иммобилизованные меченые гибриды остаются на фильтре. Сигнал, подаваемый связанным зондом, обнаруживают посредством авторадиографии, если зонд был радиоактивным, или путем образования цветных пятен, если использовали меченный ферментом зонд.
Достоинства метода: высокая чувствительность и специфичность; быстрота анализа; универсальность; отсутствие необходимости в стерильной работе, математической обработке результатов. Недостатки: относительная технологическая сложность и трудность получения зонда; если метка радиоактивная, то нельзя зонд наробатывать впрок, так как период полураспада 32Р-14 сут, а 1311- 8 сут; если метка нерадиоактивная, то чувствительность метода снижается в 10 раз и более.
Методы ДНК(РНК)-зондов из диагностической практики постепенно выясняются новым методом- полимеразной цепной реакцией.